Një filtër fluoreshent është një komponent thelbësor në mikroskopin fluoreshent.Një sistem tipik ka tre filtra bazë: një filtër ngacmimi, një filtër emetimi dhe një pasqyrë dykroike.Zakonisht ato paketohen në një kub në mënyrë që grupi të futet së bashku në mikroskop.
Si funksionon një filtër fluoreshent?
Filtri i ngacmimit
Filtrat e ngacmimit transmetojnë dritë të një gjatësi vale specifike dhe bllokojnë gjatësi vale të tjera.Ato mund të përdoren për të prodhuar ngjyra të ndryshme duke akorduar filtrin për të lejuar vetëm një ngjyrë të kalojë.Filtrat e ngacmimit vijnë në dy lloje kryesore - filtra me kalim të gjatë dhe filtra me kalim brezi.Ngacmuesi është zakonisht një filtër brezkalimi që kalon vetëm gjatësitë e valëve të absorbuara nga fluorofori, duke minimizuar kështu ngacmimin e burimeve të tjera të fluoreshencës dhe duke bllokuar dritën e ngacmimit në brezin e emetimit të fluoreshencës.Siç tregohet nga vija blu në figurë, BP është 460-495, që do të thotë se mund të kalojë vetëm përmes fluoreshencës prej 460-495 nm.
Ai vendoset brenda shtegut të ndriçimit të një mikroskopi fluoreshent dhe filtron të gjitha gjatësitë e valëve të burimit të dritës, përveç gamës së ngacmimit të fluoroforit.Transmetimi minimal i filtrit dikton ndriçimin dhe shkëlqimin e imazheve.Rekomandohet një minimum prej 40% transmetim për çdo filtër ngacmimi në mënyrë që transmetimi të jetë në mënyrë ideale >85%.Gjerësia e brezit të filtrit të ngacmimit duhet të jetë tërësisht brenda intervalit të ngacmimit të fluoroforit në mënyrë që gjatësia e valës qendrore (CWL) e filtrit të jetë sa më afër gjatësisë së valës së ngacmimit maksimal të fluoroforit.Dendësia optike e filtrit të ngacmimit (OD) dikton errësirën e imazhit të sfondit;OD është një masë se sa mirë një filtër bllokon gjatësitë e valëve jashtë gamës së transmetimit ose gjerësisë së brezit.Rekomandohet një OD minimale prej 3.0, por një OD prej 6.0 ose më e madhe është ideale.
Filtri i emisioneve
Filtrat e emetimit shërbejnë për të lejuar fluoreshencën e dëshiruar nga kampioni të arrijë në detektor.Ata bllokojnë gjatësi vale më të shkurtra dhe kanë transmetim të lartë për gjatësi vale më të gjata.Lloji i filtrit shoqërohet gjithashtu me një numër, p.sh. BA510IF në figurë (filtri i pengesës së ndërhyrjes), ai emërtim i referohet gjatësisë së valës në 50% të transmetimit të tij maksimal.
Të njëjtat rekomandime për filtrat e ngacmimit vlejnë për filtrat e emetimit: transmetimi minimal, gjerësia e brezit, OD dhe CWL.Një filtër emetimi me kombinimin ideal CWL, transmetim minimal dhe OD siguron imazhet më të ndritshme të mundshme, me bllokimin më të thellë të mundshëm dhe siguron zbulimin e sinjaleve më të dobëta të emetimit.
Pasqyrë dykroike
Pasqyra dikroike vendoset midis filtrit të ngacmimit dhe filtrit të emetimit në një kënd 45° dhe reflekton sinjalin e ngacmimit drejt fluoroforit ndërsa transmeton sinjalin e emetimit drejt detektorit.Filtrat idealë dikroikë dhe ndarësit e rrezeve kanë kalime të mprehta midis reflektimit maksimal dhe transmetimit maksimal, me një reflektim >95% për gjerësinë e brezit të filtrit të ngacmimit dhe një transmetim prej >90% për gjerësinë e brezit të filtrit të emetimit.Zgjidhni filtrin duke pasur parasysh gjatësinë e valës së kryqëzimit (λ) të fluoroforit, për të minimizuar dritën e humbur dhe për të maksimizuar raportin sinjal-zhurmë të imazhit fluoreshent.
Pasqyra dykroike në këtë figurë është DM505, e quajtur kështu sepse 505 nanometra është gjatësia e valës në 50% të transmetimit maksimal për këtë pasqyrë.Kurba e transmetimit për këtë pasqyrë tregon transmetim të lartë mbi 505 nm, një rënie të madhe të transmetimit në të majtë prej 505 nanometrash dhe reflektim maksimal në të majtë prej 505 nanometra, por gjithsesi mund të ketë njëfarë transmetimi nën 505 nm.
Cili është ndryshimi midis filtrave të kalimit të gjatë dhe brezit?
Filtrat e fluoreshencës mund të ndahen në dy lloje: kalim i gjatë (LP) dhe kalim brez (BP).
Filtrat me kalim të gjatë transmetojnë gjatësi vale të gjata dhe bllokojnë ato më të shkurtra.Gjatësia e valës së ndërprerjes është vlera në 50% të transmetimit të pikut, dhe të gjitha gjatësitë e valëve mbi ndërprerjen transmetohen nga filtrat e kalimit të gjatë.Ato përdoren shpesh në pasqyrat dykroike dhe filtrat e emetimit.Filtrat me kalim të gjatë duhet të përdoren kur aplikacioni kërkon mbledhjen maksimale të emetimeve dhe kur diskriminimi spektral nuk është i dëshirueshëm ose i nevojshëm, gjë që ndodh në përgjithësi për sondat që gjenerojnë një specie të vetme emetuese në ekzemplarë me nivele relativisht të ulëta të autofluoreshencës së sfondit.
Filtrat e kalimit të brezit transmetojnë vetëm një brez të caktuar gjatësi vale dhe bllokojnë të tjerët.Ato reduktojnë ndërlidhjen duke lejuar që të transmetohet vetëm pjesa më e fortë e spektrit të emetimit të fluoroforit, zvogëlojnë zhurmën e autofluoreshencës dhe kështu përmirësojnë raportin sinjal-zhurmë në mostrat me autofluoreshencë të sfondit të lartë, të cilin filtrat me kalim të gjatë nuk mund ta ofrojnë.
Sa lloje të grupeve të filtrave fluoreshent mund të ofrojë BestScope?
Disa lloje të zakonshme të filtrave përfshijnë filtrat blu, jeshilë dhe ultravjollcë.Siç tregohet në tabelë.
| Set filtrash | Filtri i ngacmimit | Pasqyrë dykroike | Filtri pengues | Gjatësia e valës së llambës LED | Aplikacion |
| B | BP460-495 | DM505 | BA510 | 485 nm | ·FITC: Metoda e antitrupave fluoreshente ·Acidine portokalli: ADN, ARN ·Auramine: Bacil tuberkuloz ·EGFP, S657, RSGFP |
| G | BP510-550 | 570 DM | BA575 | 535 nm | ·Rhodamine, TRITC: Metoda e antitrupave fluoreshente ·Jodidi i propidit: ADN · RFP |
| U | BP330-385 | DM410 | BA420 | 365 nm | ·Vëzhgimi i autofluoreshencës ·DAPI: Ngjyrosja e ADN-së ·Hoechest 332528, 33342: përdoret për ngjyrosjen e kromozomeve |
| V | BP400-410 | 455 DM | BA460 | 405 nm | ·Katekolamina ·5-hidroksi triptamine ·Tetraciklina: Skeleti, Dhëmbët |
| R | BP620-650 | DM660 | BA670-750 | 640 nm | ·Cy5 ·Alexa Fluor 633, Alexa Fluor 647 |
Kompletet e filtrave që përdoren në blerjet e fluoreshencës janë të dizajnuara rreth gjatësive të valëve kryesore të përdorura në aplikimet e fluoreshencës, e cila bazohet rreth fluoroforeve më të përdorura.Për këtë arsye, ato janë emërtuar edhe sipas fluoroforit që janë të destinuara për imazhe, si kube filtri DAPI (blu), FITC (jeshile) ose TRITC (e kuqe).
| Set filtrash | Filtri i ngacmimit | Pasqyrë dykroike | Filtri pengues | Gjatësia e valës së llambës LED |
| FITC | BP460-495 | DM505 | BA510-550 | 485 nm |
| DAPI | BP360-390 | DM415 | BA435-485 | 365 nm |
| TRITC | BP528-553 | DM565 | BA578-633 | 535 nm |
| FL-Auramine | BP470 | 480 DM | BA485 | 450 nm |
| Teksasi i kuq | BP540-580 | 595 DM | BA600-660 | 560 nm |
| mqershi | BP542-582 | 593 DM | BA605-675 | 560 nm |
Si të zgjidhni një filtër fluoreshence?
1. Parimi i zgjedhjes së filtrit të fluoreshencës është që të lihet drita fluoreshence/emetimi të kalojë në fundin e imazhit sa më shumë që të jetë e mundur dhe të bllokojë plotësisht dritën e ngacmimit në të njëjtën kohë, në mënyrë që të merret raporti më i lartë sinjal-zhurmë.Veçanërisht për aplikimin e ngacmimit multifoton dhe mikroskopit të reflektimit total të brendshëm, zhurma e dobët do të shkaktojë gjithashtu ndërhyrje të madhe në efektin e imazhit, kështu që kërkesa për raportin sinjal ndaj zhurmës është më i lartë.
2. Njihni spektrin e ngacmimit dhe emetimit të fluoroforit.Për të ndërtuar një grup filtri fluoreshent që gjeneron një imazh me cilësi të lartë, me kontrast të lartë me një sfond të zi, filtrat e ngacmimit dhe emetimit duhet të arrijnë transmetim të lartë me valëzim minimal të brezit të kalimit mbi rajonet që korrespondojnë me majat ose emetimet e ngacmimit të fluoroforit.
3. Merrni parasysh qëndrueshmërinë e filtrave fluoreshent.Këta filtra duhet të jenë të papërshkueshëm nga burimet intensive të dritës që gjenerojnë dritë ultravjollcë (UV) që mund të çojë në "djegie", veçanërisht të filtrit ngacmues pasi ai i nënshtrohet intensitetit të plotë të burimit të ndriçimit.
Imazhet e ndryshme të mostrave fluoreshente
Burimet mblidhen dhe organizohen në internet dhe përdoren vetëm për mësim dhe komunikim.Nëse ka ndonjë shkelje, ju lutemi na kontaktoni për ta fshirë.
Koha e postimit: Dhjetor-09-2022